目前基孔肯雅病毒（CHIKV）的检测方法涉及侵入性且昂贵的分子生物学程序作为金标准诊断方法。因此，寻找一种非侵入性、更具成本效益、无需试剂且可持续的 CHIKV 感染检测方法对于公共卫生至关重要。便携式傅里叶变换红外结合衰减全反射（ATR-FTIR）平台已应用于利用唾液鉴别全身性疾病，但唾液在病毒性疾病诊断中的应用探索较少。该研究旨在识别唾液红外轮廓的独特振动模式，以使用化学计量学和人工智能算法检测 CHIKV 感染。因此，我们用CHIKV（20μl，1 X 105 PFU/ml，n=6）或媒介物（20μl，n=7）皮内攻击干扰素-γ基因敲除的C57/BL6小鼠。第 3 天收集唾液和血清样本（由于病毒血症高峰期）。通过实时 PCR 在 CHIKV 感染小鼠的血清中证实了 CHIKV 感染。使用支持向量机 (SVM) 算法，最佳模式分类的灵敏度为 83%，特异性为 86%，准确度为 85%。我们的结果表明，唾液 ATR-FTIR 平台可以区分 CHIKV 感染，有可能成为这种新兴疾病的非侵入性、可持续且经济高效的检测工具。
基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种虫媒病毒，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播给人类。CHIKV 于 1952 年在坦桑尼亚首次分离出来，这种甲病毒在除南极洲外的各大洲 1 的多个国家造成间歇性疫情爆发。CHIKV 具有编码两种多蛋白的 12 kb 正义 RNA 基因组。它又分为四种非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3、nsP4）和其他五种结构蛋白（C、E3、E2、6 K 和 E1）3。E2糖蛋白是一种对细胞与宿主细胞结合很重要的病毒表面蛋白，而E2病毒蛋白与参与病毒进入的宿主细胞中的几种受体相互作用，包括网格蛋白、表皮生长因子受体底物15 (Eps15)、硫酸乙酰肝素、CHIKV 侵入的硫酸角质素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素4。
CHIKV 会导致人类出现炎症性肌肉骨骼疾病，并出现关节痛、关节炎和肌痛等症状3。CHIKV 感染还会导致称为基孔肯雅热 (CHIKF) 的发热性疾病，其常见症状是多关节痛，主要发生在大关节（膝盖和肘部）和周围关节（脚踝、手腕和指骨）2,5。CHIKV 的急性期发生在感染后一周，而慢性期在人类中可能持续数月至数年。急性发热和多关节痛是 CHIKV 感染症状的主要因素1,6。欧洲疾病预防和控制中心（ECDC）的数据显示，全球报告了 383,357 例 CHIKV 感染病例，主要报告在巴西、印度、巴拉圭、危地马拉和泰国7。
CHIKV 诊断的具体测试是主要基于血液样本，所使用的测试类型取决于症状出现后的采集时间8。这些测试基于使用实时定量逆转录 PCR (qRT-PCR)10,11,12 进行的病毒 RNA 检测9，或基于使用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 检测针对 CHIKV 的特异性 IgM 和 IgG 抗体的血清学测试。) 和/或快速免疫层析 assys13。在 COVID-19 大流行之后，唾液病毒成分检测已成为一种重要的替代方案14,15,16,17。唾液检测可以被认为是诊断全身性疾病的一个有趣的选择。唾液成分包括有机和无机元素，例如电解质、肽、蛋白质、碳水化合物、核酸和包括病毒在内的病原体。唾液自动采集是一种相对快速、无痛、省力、安全的非侵入性采集方法；与血液相比，唾液也更方便储存18。一些研究证实唾液中存在 CHIKV，在症状出现后的第一周内，58.3% 的唾液样本中检测到了 RNA19。此外，从几名有出血表现的急性CHIKV患者采集的唾液样本中也含有病毒RNA和传染性病毒20。
傅里叶变换红外结合衰减全反射（ATR-FTIR）光谱的应用有助于检测几种新出现的病毒感染。ATR-FTIR 是一种基于中红外区域21 的强大分析工具，用于生物体液22,23,24,25,26,27,28 的定量和定性分析，是一种出色的光谱技术21。ATR-FTIR 可以提供有关蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物表征的信息26。电磁频谱区域包括 4000400 cm1 范围。在生物样本中，1800 至 900 cm1 之间的范围被称为生物指纹区域29,30。
在这里，我们测试了这样的假设：独特的光谱唾液生物标志物可以在 CHIKV 感染小鼠的唾液中差异表达用作 CHIKV 检测的唾液红外标记。在此背景下，本研究旨在识别唾液红外轮廓以检测 CHIKV 特征，并基于在可持续便携式生物光子平台中获得的红外光谱来评估化学计量分析和机器学习算法的准确性。
干扰素-γ基因敲除C57/BL6雄性小鼠（29.5克，约2个月大）分为：媒介物（n = 7）和CHIKV（n = 6）。这些动物被维持在标准条件下（22±2℃，55％5％湿度，12小时光/暗循环，早上5点开灯），并允许在生物多样性和实验中心自由获取标准饮食和水。（REBIR）在乌贝兰迪亚联邦大学（UFU）。小鼠左后足垫接种一次（20 L，1 105 PFU/mL），对照小鼠接受无菌溶液（20 L）中的载体[生理盐水，氯化钠 0.9%]（图 1）。根据巴西动物实验学院 (COBEA) 采纳的伦理原则和 ARRIVE 指南，所有实验程序均经 UFU 动物研究伦理委员会批准（许可证 CEUA-UFU #023/2021）。
在第 3 天，由于病毒血症31达到峰值，用 12 mg/kg 的甲苯噻嗪和 80 mg/kg 的氯胺酮麻醉媒介物和 CHIKV 动物，随后，这些小鼠接受毛果芸香碱（2 mg/kg，腹腔注射）以刺激唾液分泌（图 1）。收集唾液5分钟，并将样品储存在-80°C直至进一步分析。此外，还收集血液，并在冷冻离心机Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R中以2500rpm离心15分钟分离血清。通过放血对动物实施安乐死，这一过程涉及将针插入心腔，然后抽血。
RNA 提取使用 Maxwell RSC 病毒总核酸纯化试剂盒（Promega，美国）32 在 Maxwell 16 RSC 提取系统（Promega，美国）上自动提取血清样品。此过程之后，使用 GoScript 逆转录酶（Promega，美国）和 OligoDT（Promega，美国）将病毒 RNA 用于 cDNA 转录。按照制造商的说明，使用 GoTaq qPCR 主混合物 A6002（Promega，美国）在 Applied Biosystems 7300 实时 PCR 系统（Applied Biosystems，美国）中扩增样品，并采用引物设计来靶向 CHIKV E 区域：(5-GTCACATACCACCCTCG-3) 和反向 (5-TGYCTCTTAGGGGACACATATACCT-3)33。
记录唾液样品的光谱使用连接至微衰减全反射 (ATR) 模式的便携式 Agilent Cary 630 FTIR 光谱仪，测量范围为 4000 至 650 cm1。每个样品的光谱分辨率为 2 cm1，每个光谱进行 64 次扫描（共同添加）。将装有唾液的聚丙烯微管插入涡旋 3 分钟以匀浆样品，然后插入 2 升唾液直接在 ATR-crystal 上干燥。使用气流直接进入样品 5 分钟后，单独收集每个干燥唾液光谱34。
使用 Orange 3.3.5 软件处理唾液红外图谱。为了生成平均光谱，通过橡胶带方法校正基线，然后进行最小最大归一化，以避免整个样品制备和光谱分析过程中的错误。然后，红外剖面截断堆肥的脂质区域（30502800 cm1）和指纹区域（1800900 cm1），以输入化学计量分析数据作为主成分分析（PCA）27。在 PCA 分析中，每个振动模式都被投影到一个由主要主成分专门识别的新子空间上，以获得降维数据，即使部分保留了数据变化。在光谱数据的探索性（无监督）分析中，主成分由分数（样本方向的偏差）和载荷（波数方向的方差）组合而成35。
使用最先进的机器学习算法和线性判别式测试分类。特征提取分析与判别分析工具相结合。基于模型训练期间更好的结果，选择了线性判别分析（LDA）和支持向量机（SVM）算法。LDA 通过将原始数据投影到较低维度的空间，将患者组或测量值分组。SVM 是一种监督学习技术，通过投影在高维空间中的数据拟合超平面，从而可以对光谱或患者数据进行分类。应用五次分层交叉验证来分析LDA和SVM算法的预测性能。在此过程中，样本被分为 5 个不相交的集合，并且在每次运行中，使用 4 组作为训练数据，1 组专门用作测试数据，总共运行 5 次。为了衡量获得的结果，使用了三个预测性能指标：敏感性、特异性和准确性。敏感性或真阳性率是正确分类的阳性样本（感染CHIKV的动物）的比例，特异性或真阴性率是正确分类的阴性样本（对照动物或载体）的比例。准确度定义为考虑真阴性和假阴性的情况下正确分类的总样本的百分比27,30。
Shapley Additive Explanations (SHAP) 是解释人工智能算法的有效模型。因此，SHAP 计算每种振动模式对目标值的贡献。性能最佳的人工智能模型中每个振动的 SHAP 值可以帮助识别哪些特征更有利于区分阳性样本（感染 CHIKV 的动物）和阴性样本（对照动物或车辆）36。
CHIKV 感染小鼠（CHIKV：29 0.9 g）的体重相似（p